《基於CRISPR Cas13a系統建立大口黑鱸彈狀病毒檢測方法》

張敏琳, 黃楓淇, 左小玲, 梁建韜, 梁凱珊, 單金紅, 李宗烊, 喻婕, 羅麗媛, 禤梓傑, 趙會宏, 王慶. 

基於CRISPR/Cas13a系統建立大口黑鱸彈狀病毒檢測方法[J]. 水生生物學報, 2024, 48(2): 283-291. DOI: 10.7541/2023.2023.0199

大口黑鱸（Micropterus salmoides），也叫加州鱸或美國黑鱸，是一種原產於北美的淡水魚類，近年來在全球範圍內成為一種重要的養殖魚類，因其市場需求高：大口黑鱸肉質緊實、刺少，味道鮮美，營養豐富，尤其富含高蛋白和低脂肪，符合消費者對健康食品的需求，因此市場售價較高，常用於高端餐飲市場。生長快：大口黑鱸生長速度較快，一般6-8個月可以達到商品規格，適合短周期養殖，能快速實現投資回報。抗病力強：相較於其他養殖魚類，大口黑鱸對環境適應能力強，較少爆發大規模疾病，降低了養殖風險。生態養殖：大口黑鱸可以與其他淡水魚類如鰱魚、草魚等混養，有助於實現池塘生態平衡和資源利用最大化，進一步提高養殖效益等因素，受到食客們與水產養殖戶們的歡迎，近年來其養殖規模快速增長。

彈狀病毒科

大口黑鱸雖然較為抗病，但在不良養殖環境下仍可能患上一些疾病，其中大口黑鱸彈狀病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV）危害巨大：最早於1991年在美國佛羅里達州被發現，該病毒最初是在野生大口黑鱸群體中檢測到，隨後逐漸在美國的多個淡水湖泊和水庫中傳播開來，成為大口黑鱸的主要病原之一。

透射電鏡下觀察病變細胞中的病毒粒子的形態大小

章文言，張玉軍，李陳，等.大口黑鱸彈狀病毒的分離與鑑定［J］.華中農業大學學報，2022，41（6）：230‐236.

ZHANG Wenyan,ZHANG Yujun,LI Chen,et al.Isolation and identification of Micropterus salmoides rhabdovirus[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2022,41(06):230-236.

傳播源常為受感染的魚苗或成魚、受污染的水體、以及攜帶病毒的野生魚類；這種病毒可以通過直接接觸、糞便排泄、以及水體傳播，在不良水質或高密度養殖條件下更易擴散。該病毒能引起幼魚嗜睡、漫遊、腹部腫脹和體形扭曲, 以及誘導壞死性潰瘍和多器官出血, 一旦感染死亡率超過 90%。』

人工感染後大口黑鱸的臨床症狀

章文言，張玉軍，李陳，等.大口黑鱸彈狀病毒的分離與鑑定［J］.華中農業大學學報，2022，41（6）：230‐236.

ZHANG Wenyan,ZHANG Yujun,LI Chen,et al.Isolation and identification of Micropterus salmoides rhabdovirus[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2022,41(06):230-236.

每年因MSRV導致的大口黑鱸魚苗損失超過30%, 目前關於該病毒的治療與檢測方法還不成熟, 並沒有特效藥可以醫治，故很有必要在感染之前及時發現病毒並做好有效的防範措施, 能夠在一定程度上減少養殖過程中的損失；

此外現有檢測技術較難做到在無複雜檢測設備的情況下開展現場檢測，面對這一挑戰，華南農業大學的研究團隊開發出了一種MIRA結合CRISPR-系統的全新檢測方法，該方法特異性強, 靈敏度高並且操作簡便, 極大提升了MSRV的檢測效率，也為儘早發現MSRV採取防控措施提供幫助。

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MIRA引物對篩選

使用兩對不同MIRA引物對含有靶序列的基因片段進行擴增, 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖位於100 bp的位置, 3個泳道均出現明亮的條帶, 表明有非特異性擴增產物。泳道2和3中250 bp處為擴增的目的條帶。用Image J軟件分別將電泳圖泳道2中長度為224 bp和泳道3中長度為255 bp的目的條帶進行定量分析, 並用「灰度值」表示定量分析的結果。從分析結果得出, 灰度值越低表示引物利用率高, 即引物特異性結合擴增效率高。

結果表明: 採用MIRA-F2/R2引物對時, 特異性結合擴增效率高。

MIRA引物對篩選電泳膠圖以及灰度值分析

a. 泳道M: 2000 bp DNA marker; 泳道1. 陰性DNA樣品擴增; 泳道2. MIRA-F1/R1引物對擴增目的片段(方框所示224 bp);

 泳道3. MIRA-F2/R2引物對擴增目的片段(方框所示255 bp); b. 條帶灰度值分析(方框所示)

CRISPR/Cas13a檢測體系

CRISPR/Cas13a檢測體系反應結束後用紫外燈進行照射, 觀察結果。

CRISPR/Cas13a-MSRV最佳反應體系

bbin宝盈(中国)分別用RNA標準品和擴增的樣品RNA進行實驗,靶向目標RNA的定位速度, crRNA2要優於crRNA1; crRNA1比crRNA2有更強的最終熒光信號; crRNA1+crRNA2等比例混合使用能綜合兩者的優點, 反應效率更好。 

a. 用不同間隔序列的crRNA檢測標準品RNA的檢測結果比較; b. 檢測系統在不同溫度下檢測標準品RNA的熒光信號數據比較; 

c. 用不同濃度的RNA報告探針檢測標準品的熒光信號數據比較; d. 用不同濃度比率的Cas13a/crRNA探針複合物檢測標準品的檢測結果比較；

探究反應溫度對檢測系統的影響, 設置了31℃、34℃、37℃和41℃不同反應溫度, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測體系最佳反應溫度是37℃。 

探究ssRNA報告探針濃度對檢測系統的影響, 在測試範圍內, 熒光強度與ssRNA報告探針濃度呈正相關, ssRNA報告探針濃度在 500-700 nmol/L檢測效果差異不大, 考慮到現實經濟問題, 最佳的ssRNA報告探針濃度為500 nmol/L。 

為探究不同Cas13a與crRNA的反應濃度比對檢測系統的影響, 當以每份100 nmol/L比例的基礎上，Cas13a﹕crRNA的比例為4﹕1和3﹕1時, Cas13a達到飽和狀態; 當Cas13a數量一定時, 熒光信號的強度並沒有與crRNA數量的增加呈正相關。因此, Cas13a與crRNA比例為2﹕1時, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統能夠獲得最大的檢測活性。 

靈敏度評估

為探究CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統對MSRV的最低檢測濃度, 故將RNA標準品進行10倍梯度連續稀釋, 並用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統進行檢測。 CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統至少能檢測到102 fM MSRV的目標RNA。當目標RNA濃度低於102 fM時, 機器檢測到的熒光信號與空白對照無明顯差異。因此, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統至少能檢測到102 fM MSRV的ssRNA。 

 評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統對MSRV的靈敏度

特異性評估

為評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統的特異性, 使用優化後的CRISPR/Cas13a檢測系統檢測不同的水產RNA病毒, 包括RGNNV、BFNNV和TPNNV。只有MSRV的檢測體系能檢測出熒光信號, 其他病毒的檢測體系檢測出的熒光信號與陰性對照無差別, 為陰性結果。這表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統可特異性靶向MSRV, 該檢測方法特異性很好。 

評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統對MSRV的特異性

樣品檢測

對從鱸魚養殖場採集有明顯患病跡象的病魚樣品, 驗證病魚所感染病原體是否為MSRV, 使用MSRV衣殼蛋白序列特異性引物進行PCR擴增, 電泳圖中相對應條帶送測, 比對確認為MSRV。 

對感染了MSRV的病魚樣品進行預處理和預擴增病毒RNA, 然後與陰性對照組進行檢測。同時提取樣品的cDNA做常規檢測qPCR進行比較。 用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統檢測出陽性樣品(3、6、7、8、9、12、13、14和15號)與常規檢測qPCR的結果一樣, 其中qPCR的CQ值處於18-25; 而陰性樣品(1、2、4、5、9、10和11號)閾值循環數則都大於38, 表明樣品無攜帶MSVR病毒。綜上所述, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統與常規檢測RT-qPCR的檢測數據相符合, 表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統的可行性且在一定程度上可以代替原先常規繁雜的檢測方法。 

a. qPCR檢測MSRV臨床樣品閾值循環數圖; 將檢測到的樣本循環數分別與陰性參照循環數用T-tests 分析(**P<0.01);

 b. Cas13a結合MIRA檢測MSRV臨床樣品熒光圖; 將檢測到的樣本熒光值分別與陰性參照熒光值用T-tests分析(**P<0.01)

綜上所述, 本研究建立的CRISPR/Cas13a-MSRV檢測方法不需要昂貴的實驗儀器, 可使現場檢測變得快速、準確且方便。因此, 在實際養殖過程中如果採用該種檢測方法對MSRV進行及時的發現, 並採取針對性的有效措施, 這在很大程度上能夠減少養殖過程中病害帶來的損失, 並且該檢測方法快捷、靈敏度高、特異性高, 具有較大的應用和推廣前景。

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