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海外科研新進展近日美國密西西比州立大學海岸研究和推廣中心的Park教授發表了文章《Development of Multienzyme Isothermal Rapid Amplification (MIRA) Combined with Lateral-Flow Dipstick (LFD) Assay to Detect Species-Specific tlh and Pathogenic trh and tdh Genes of Vibrio parahaemolyticus》,收錄在SCI期刊《Pathogens》。實驗中建立了一種MIRA-LFD檢測副溶血性弧菌快速、簡單的方法。在資源有限的田間條件下,不僅能快速檢測副溶血性弧菌的tlh基因,還能快速檢測該基因的兩個致病性trh和tdh基因。 副溶血性弧菌 副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性的嗜鹽細菌,生活在世界範圍內溫暖的河口和海洋環境中。它是重要的食源性致病菌之一,通常發生在人們在食用受污染的生的、未煮熟的海鮮後。美國疾病控制和預防中心估計,在美國約有84,000人因弧菌感染而遭受食源性疾病。 副溶血性弧菌的trh基因編碼的耐熱相關溶血素和tdh基因編碼的耐熱直接溶血素,已被認為是副溶血性弧菌誘導的胃腸炎致病性的關鍵指標。並且tlh基因編碼耐熱性溶血素大多數毒力分離株顯示trh和/或tdh陽性。 實驗方法 實驗中分別將正向、反向引物和探針加入到MIRA試劑,在40◦C下孵育15 min進行擴增反應。再用羧基熒光素(FAM)和抗原標記(生物素)標記,將MIRA產物用雜交檢測緩衝液稀釋。將LFD的樣品墊浸泡在稀釋後的溶液中,室溫下孵育2 min,觀察條帶顯色。同時採用qPCR、PCR方法做了實驗對比,驗證MIRA-LFD靈敏度。 (MIRA-LFD檢測tlh、tdh和trh基因工作流程) 靈敏度: (分別使用MIRA-LFD、qPCR、PCR檢測gDNA樣本和細菌培養樣本) 實驗使用了4個10倍連續稀釋的樣本,從1 pg到1 fg分別做了檢測;細菌培養樣本從2×103 CFU到2 CFU。 MIRA-LFD對tlh、tdh和trh基因的檢測結果分別為10 fg、細菌培養2 CFU。 特異性: 利用副溶血性弧菌和其他食源性致病菌的基因組DNA評估MIRA-LFD的特異性,MIRA-LFD檢測結果顯示,陽性對照副溶血性弧菌F11-3A的tlh、trh和tdh基因的檢測品系呈陽性,其他則顯示陰性。 MIRA-LFD對靶基因具有高度特異性,但與其他密切相關的細菌沒有交叉反應。 (MIRA-LFD檢測副溶血性弧菌及其他弧菌和食源性致病菌) 實驗結論 通過MIRA-LFD檢測準確擴增基因的靶區,並在20 min內提供檢測結果。可檢測到低至10 pg的gDNA和2 CFU的副溶血性弧菌,具有較高的特異性
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