《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated 「one-pot」dual detection assay for genetically modified crops》

轉基因作物已在世界各地廣泛種植，許多國家逐步完善轉基因監管措施以確保轉基因作物的安全。開發快速和準確的基因現場檢測方法對農業和生物安全非常重要，可以減輕公眾對轉基因產品的擔心。

在本研究中，課題組開發了一種新的一鍋法反應——雙重MIRA檢測結合雙重CRISPR（MR-DCA方法），用於同時檢測轉基因作物中的CaMV35S和NOS遺傳靶點，為轉基因作物的檢測提供了一種簡單高效的檢測方法。

實驗方法

將雙重MIRA產物用雙Cas13a、Cas12a系統進行分析，產生兩個互不干擾的獨立信號，再通過照明儀器讀取熒光顏色，或通過帶有兩條T線的試紙條，以實現雙通道讀出。整個過程在不到35 min的時間內完成，檢測限低至20個拷貝。

（MR-DCA檢測CaMV35S和NOS的原理）

整個實驗分為3個步驟：MIRA擴增、CRISPR反應、2種方式的結果判讀。

CaMV35S基因作為Cas13a的靶標，NOS基因作為Cas12a的靶標，分別設計了兩對MIRA引物。Cas13a系統只識別RNA，因此設計了正向引物區域，包含一個T7啟動子，用於後續轉錄，激活Cas13a。為NOS基因增加一個PAM 。以上的這些的添加確保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以與各自的crRNA結合，且兩個系統之間不存在干擾或交叉反應。

實驗情況

l 靈敏度和特異性

將樣本梯度稀釋來測試MIRA反應的熒光強度，發現樣本濃度在20μL時仍能檢測到熒光強度，最終實驗選定20μL的濃度。

（不同樣本濃度和試紙條顯色測試並用強度量化計算）

為了進一步評價MR-DCA的特異性，課題組對非轉基因動物混合樣品和非轉基因植物混合樣品進行了檢測。結果顯示只有含有CaMV35S和NOS的轉基因樣品具有較高的熒光信號，而其他樣品的熒光強度與陰性對照比較接近。MR-DCA可作為一種特定的雙靶點核酸檢測平台。

用MR-DCA對24個作物樣品進行了測試。 其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S啟動子的轉基因玉米。7、8、23、24是含有NOS終止子的抗病轉基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S啟動子和NOS終止子轉基因大豆。

（24個樣本的檢測結果）

l反應快速

反應時間是現場檢測的一個重要因素，課題組觀察到在反應時間為10 min時，就已經能用熒光儀檢測到FAM和HEX的熒光信號。MIRA結合CRISPR反應，也在15min後觀察到黃色熒光。

（不同MIRA反應時間下的熒光信號）

（MIRA反應不同時間下的試紙條顯色並用強度量化計算）

l 實驗結論

實驗結果表明，該雙重MIRA具有良好的特異性，並能準確地獲得CaMV35S和NOS的擴增產物，Cas13a和Cas12a系統獨立反應，互不干擾。MR-DCA檢測能在35min的低溫下準確檢測到20個拷貝，具有在田間檢測轉基因作物的巨大價值。

文章信息

期刊名稱：《Journal of Advanced Research》

文章標題：《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated 「one-pot」dual detection assay for genetically modified crops》

影響因子：11.4

研究團隊：浙江省農業科學院汪小福

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