文章標題：A suboptimal PAM-driven one-tube CRISPR/Cas12a assay for extraction-free and ultra-rapid detection of African swine fever virus

發表單位：山西農業大學獸醫學院等

發表期刊：Sensors and Actuators: B. Chemical

影響因子：7.7

MIRA 技術本身具備等溫、快速、簡便等特點，在現場操作擁有顯著優勢。研究團隊顺利获得優化，將MIRA技術與CRISPR-Cas12a平台完美整合，解決了傳統兩步法檢測中易開蓋污染和擴增產物損失的問題，同時顺利获得次優PAM調控Cas12a活性，實現One-Pot擴增與檢測同步。

該平台可實現免提取、現場快速操作，檢測單管兼容，靈敏度可達1copy/μL，特異性良好，為快速、精準、現場可操作的ASFV檢測给予核心技術支撐。

實驗方法設計

樣本（血液、血漿或拭子）經快速核酸釋放處理後，MIRA在單管中快速擴增靶核酸，為Cas12a给予足量底物，動力學匹配Cas12a切割反應，增強信號放大。

側流試紙由樣本墊、共軛墊（AuNPs+anti-FAM）、C線（鏈霉親和素）和T線（山羊抗鼠二抗）組成，未切割探針在C線形成紅條，Cas12a激活後切割探針，FAM片段遷移至T線形成紅條，實現結果判讀。整個流程可在約20分鐘內完成，靈敏度高（1copy/μL）、特異性強且無需儀器操作，適合現場快速檢測。

MIRA技術在其中核心作用是快速累積擴增產物、保證Cas12a檢測信號充分釋放，支撐平台的高效靈敏檢測性能。

（用於核酸可視化檢測的試紙條示意圖）

寡核苷酸的設計與優化

實驗中顺利获得比較不同引物對及不同crRNA在MIRA等溫擴增體系下的信號輸出情況，篩選最優組合，為現場快速檢測给予可靠的擴增和信號基礎。

• 快速等溫擴增：MIRA给予高效多酶恆溫擴增，使得在37℃條件下迅速形成足量擴增產物，為Cas12a檢測给予充分模板。

• 信號放大與兼容性：MIRA與Cas12a協同工作，保證擴增產物與CRISPR檢測體系匹配，避免過早切割導致信號損失。

• 增強靈敏度與特異性：顺利获得MIRA的快速擴增能力，該實驗能夠明顯區分不同引物/crRNA組合，幫助篩選最佳檢測組合，從而提升整體檢測靈敏度和特異性。

（MIRA引物和crRNA的篩選）

不同PAM序列介導的crRNAs特性研究

• Panel A–B（兩管體系）：TTTV PAM顯示快速且高強度熒光信號，TVTV PAM信號明顯減弱，說明在兩管體系中PAM活性過強會影響擴增與切割的協調。

• Panel C–D（sCRAM One-Pot平台）：採用次優PAM（TVTV）在sCRAM平台中產生更高的熒光信號上升速度和最終強度，顯示sCRAM平台顺利获得MIRA的快速擴增與Cas12a檢測相匹配，充分釋放擴增產物信號，顯著提升靈敏度。對照組（NC）在所有條件下均未產生明顯信號，證明檢測特異性良好。

sCRAM平台結合MIRA等溫快速擴增和次優PAM Cas12a檢測，可在單管體系中實現快速、靈敏、特異的ASFV核酸檢測，相較傳統兩管體系顯著提升了檢測效率和信號釋放效果，是One-Pot現場快速檢測的核心技術支撐。

（不同PAM序列介導的crRNAs的特性）

SCRAM檢測ASFV的特異性

sCRAM平台結合MIRA等溫快速擴增和Cas12a檢測能夠在多種常見豬病毒背景下實現高度特異的ASFV核酸檢測，UV和LFS均可直觀讀取結果，為現場快速、靈敏且特異的ASFV檢測给予核心技術支撐。

（SCRAM法檢測ASFV的特異性評價）

樣本驗證

實驗中收集111份實際樣本，其中20份ASFV陽性樣本，91份陰性樣本（包含健康豬樣本及其他常見豬病毒樣本，例如PRRSV、PPV、JEV、PCV、PRV等）分別使用sCRAM One-Pot 平台的UV檢測與LFS檢測與qPCR試劑盒對比，顯示了極高的靈敏度與特異性。

sCRAM平台依託MIRA等溫快速擴增與Cas12a檢測，實現 單管、快速、靈敏、特異的ASFV核酸檢測，在UV光和試紙兩種讀取方式下均表現出高診斷性能，為現場快速病毒檢測给予核心技術支撐。

（ASFV檢測的臨床表現分析)

課題組梳理比較了多種分子診斷方法在ASFV核酸檢測中的性能，從以下三個方面進行對比。

• 樣本處理的簡便性：大多數方法依賴DNA提取試劑盒，而sCRAM平台實現免提取處理，簡化操作流程。

• 檢測限：傳統qPCR靈敏度為1.28 copies/μL（質粒），RPA/RAA為 100 copies/μL，LAMP為10–30 copies/μL，CRISPR組合方法為 5.7×10^4–10 copies/μL；而sCRAM平台的 LOD 達到1 copy/μL，表現出最高靈敏度。

• 檢測時間：傳統qPCR和ddPCR需62–110分鐘，RPA/RAA、LAMP及 CRISPR組合方法 25–60 分鐘；sCRAM平台僅需 20 分鐘即可完成檢測。

總體優勢：sCRAM 在靈敏度、快速性和免提取操作上均優於其他方法，特別適合現場快速檢測，兼顧高靈敏度、操作簡便和低設備依賴。

創新優勢

• 基於MIRA等溫快速擴增技術構建了sCRAM One-Pot CRISPR-Cas12a 平台，實現了非洲豬瘟病毒（ASFV）核酸的免提取、單管、快速、靈敏、特異檢測。

• MIRA技術给予多酶等溫擴增，快速累積ASFV核酸擴增產物，作為 Cas12a底物直接觸發切割反應，顯著提升檢測靈敏度（LOD 可達1 copy/μL）。結合次優PAM設計，使擴增與切割同步進行，避免過早切割導致信號損失，實現信號放大與快速判讀無縫銜接。

• MIRA技術與LbaCas12a以及LFS或UV檢測方式高度兼容，使檢測結果可直觀讀取，同時支持單管操作，極大簡化操作流程並降低交叉污染風險。

整體而言，MIRA技術不僅是sCRAM平台實現高靈敏、快速和現場可操作檢測的核心驅動力，也為未來病毒快速篩查與多樣本高通量檢測给予了技術基礎和可推廣方案。

bbin宝盈(中国)MIRA技術

MIRA多酶恆溫快速核酸擴增是真正實現現場快檢的技術。